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基于Chimeric antigen receptor T cells (CAR-T)技術(shù)的細(xì)胞治療可謂是當(dāng)下火熱的腫瘤治療方法之一。與早期的基于T細(xì)胞的Adoptive cell transfer(ACT)不同，CAR-T技術(shù)融入B細(xì)胞，也就是抗體的識別能力。因此CAR-T能靶向MHC異常表達(dá)或不表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，并能作用于多數(shù)傳統(tǒng)ACT無法靶向的細(xì)胞膜表面靶點(diǎn)[1]。隨著在B細(xì)胞血液腫瘤領(lǐng)域的巨大成功，CAR-T療法的臨床前研究和臨床試驗(yàn)發(fā)展迅速。目前，就臨床數(shù)目而言，CAR-T療法在腫瘤免疫領(lǐng)域僅次于基于免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療法。中國和美國則是推動(dòng)CAR-T療法臨床轉(zhuǎn)化的主力軍[2]。相較于美國，接近八成的國內(nèi)研究已處于臨床階段。同時(shí)，對比2018年，我們可以看到國內(nèi)制藥企業(yè)對于CAR-T療法的布局和推動(dòng)[2]。與傳統(tǒng)的基于化合物和抗體的直接細(xì)胞殺傷不同，基于CAR-T細(xì)胞的腫瘤殺傷是細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的結(jié)果。因此，在分析殺傷中，檢測方法必須能夠特異區(qū)別靶細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)和效應(yīng)細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞)。常見的細(xì)胞活力檢測法，如MTT、CCK-8和ATP法等，則不適于直接用于CAR-T介導(dǎo)的特異細(xì)胞殺傷檢測。針對區(qū)分的需求，我們提供兩大金標(biāo)準(zhǔn)檢測法：基于放射的51Cr釋放法和基于非放射的DELFIA® EuTDA細(xì)胞毒法[7]。兩種方法都基于利用探針、特異的標(biāo)記靶細(xì)胞。經(jīng)效應(yīng)細(xì)胞殺傷后，靶細(xì)胞出現(xiàn)裂解，并釋放探針到上清中用于定量殺傷效果。除了支持特異檢測細(xì)胞殺傷外，51Cr釋放法和 DELFIA® EuTDA細(xì)胞毒法的另外一大優(yōu)勢就是靈活性，支持多種細(xì)胞系和原代細(xì)胞作為靶細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞。例如，在近期的靶向CD19的CAR-T臨床研究中，科研人員通過標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，利用51Cr釋放法證明低親和力的CAR-T 具有更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷能力。而在后續(xù)的CAR-T無效的病人樣本研究中，基于同樣的檢測方法，科研人員通過標(biāo)記CAR-T細(xì)胞作為靶細(xì)胞，檢測病人針對CAR-T細(xì)胞是否具有免疫反應(yīng)(Anti-CAR反應(yīng))[9]。通過改變靶細(xì)胞，我們提供的方法學(xué)還支持CAR-T療法的安全性分析，例如檢測On target, off tumor脫靶效應(yīng)帶來的細(xì)胞毒性[10]。此外，同種異體反應(yīng)也逐漸成為CAR-T療法安全性評價(jià)的一個(gè)重要考慮因素。針對此，我們提供DELFIA®BrdU 細(xì)胞增殖方法，通過混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)衡量CAR-T細(xì)胞的同種異體反應(yīng)[11]。利用51Cr釋放法檢測脫靶效應(yīng)的細(xì)胞毒性，圖片來源于參考資料[10]；3D類器官和微組織球研究是當(dāng)下多個(gè)科研和制藥領(lǐng)域的熱門主題和方向，也是我們成像應(yīng)用的重要關(guān)注點(diǎn)。針對多種腫瘤，基于小分子藥物的研究已證實(shí)3D腫瘤組織樣本能有效預(yù)測藥物敏感度[14]。在CAR-T和細(xì)胞治療研究方向，3D水平研究也逐漸嶄露頭角。在近期的研究中，Opera Phenix高內(nèi)涵平臺(tái)被用于衡量、對比靶向Mesothelin的CAR-T細(xì)胞的殺傷能力 [15] 。除了3D水平研究外，活細(xì)胞動(dòng)態(tài)監(jiān)測也會(huì)成為我們針對CAR-T研究的主要開拓點(diǎn)。與干細(xì)胞類似，CAR-T細(xì)胞和免疫細(xì)胞在活化和行使功能過程中是代謝水平高度動(dòng)態(tài)的，并持續(xù)存在和癌細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞的相互作用 [16]。因此，基于成像的動(dòng)態(tài)分析非常適合在體外深入解析CAR-T細(xì)胞的功能潛能。圍繞CAR-T臨床前研發(fā)，IVIS系列能協(xié)助建立多種常見的實(shí)體瘤和血液瘤模型，靈敏追蹤腫瘤的進(jìn)展和動(dòng)態(tài)評估CAR-T細(xì)胞的抗癌作用。在此基礎(chǔ)上，IVIS系列還可以和多種新興的技術(shù)聯(lián)用，協(xié)助建立復(fù)雜的腫瘤表型。例如，在靶向多發(fā)性骨髓瘤的CAR-T臨床治療中，一個(gè)常見的挑戰(zhàn)就是BCMA陰性腫瘤細(xì)胞的存在和出現(xiàn)。對此，研究結(jié)合Crispr技術(shù)，建立融合螢火蟲報(bào)告基因的BCMA陰性腫瘤細(xì)胞，并將其混合BCMA陽性腫瘤細(xì)胞建立腫瘤模型?；铙w成像數(shù)據(jù)可以看出，BCMA CAR-T細(xì)胞無法作用于BCMA陰性腫瘤細(xì)胞，而靶向GPRC5D的CAR-T細(xì)胞能有效*BCMA陰性腫瘤細(xì)胞[17]。同樣基于Crispr技術(shù)，近期的研究利用活體成像平臺(tái)開展和驗(yàn)證靶向CD8 T細(xì)胞的活體Crispr篩選，為靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的免疫治療提供了新的靶點(diǎn)[18]。通過改變接種的流程和治療策略，IVIS系列還可以協(xié)助建立腫瘤復(fù)發(fā)、晚期腫瘤和病人來源移植腫瘤模型。在近期的一份研究中，科研人員展示了CAR-T細(xì)胞遷移能力對于殺傷效果的重要性[19]。利用腫瘤細(xì)胞，尤其是在輻射處理后，會(huì)過表達(dá)IL-18的特點(diǎn)，研究人員改造CAR-T細(xì)胞，使其過表達(dá)IL-18受體 CXCR-1或CXCR-2來提升體內(nèi)的遷移能力。結(jié)合帶有報(bào)告基因的CAR-T細(xì)胞和過表達(dá)遠(yuǎn)紅外蛋白iRFP720的腫瘤細(xì)胞，研究就能直觀追蹤和對比免疫細(xì)胞的分布變化和腫瘤的進(jìn)展情況，做到體內(nèi)水平的細(xì)胞細(xì)胞相互作用研究。相較于對照細(xì)胞，改造的CAR-T細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力和殺傷腫瘤能力。同時(shí)，在晚期腫瘤模型上，研究證實(shí)未改造CAR-T細(xì)胞主要分布于外周，不能有效靶向腫瘤部位[19]。進(jìn)一步結(jié)合免疫熒光技術(shù)，研究證實(shí)了由IVIS采集的化學(xué)發(fā)光信號能有效反映治療早期的CAR-T細(xì)胞浸潤情況，是腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞活體追蹤的有力手段。同時(shí)，治療早期的化學(xué)發(fā)光信號也能有效預(yù)測小鼠的生存時(shí)間，為CAR-T療效預(yù)測提供了新的切入點(diǎn)。后，同時(shí)結(jié)合腫瘤和CAR-T細(xì)胞活體成像，我們還能做到靶向CAR-T細(xì)胞功能水平的持續(xù)監(jiān)測。在腫瘤消退后，我們再次植入腫瘤細(xì)胞，建立Re-challenge模型，通過活體成像直觀評價(jià)CAR-T細(xì)胞的長期分布和功能[19]。利用免疫熒光和活體成像技術(shù)追蹤治療早期CAR-T細(xì)胞的侵潤情況；CD45指示CAR-T細(xì)胞，圖片來源于參考資料[19]